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熒光定量pcr技術(shù)原理及步驟

更新時(shí)間:2025-02-23   點(diǎn)擊次數(shù):137次
  熒光定量PCR技術(shù)是一種在PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),通過實(shí)時(shí)監(jiān)測每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物的熒光信號(hào),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板的定量及定性分析的技術(shù)。熒光定量PCR的原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),這些熒光基團(tuán)會(huì)隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行而釋放出熒光信號(hào)。通過實(shí)時(shí)監(jiān)測這些熒光信號(hào)的強(qiáng)度變化,可以反映出PCR反應(yīng)的進(jìn)程和結(jié)果。具體來說,在PCR反應(yīng)的指數(shù)期,模板的Ct值(即達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)的循環(huán)數(shù))和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系,因此可以通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,再根據(jù)樣品的Ct值在該曲線上確定其所含起始模板的數(shù)量。
  

熒光定量pcr技術(shù)

 

  1、設(shè)計(jì)并合成引物:這是目標(biāo)基因引物的設(shè)計(jì)和合成,確保其特異性和有效性。引物是PCR擴(kuò)增的關(guān)鍵,它們決定了PCR反應(yīng)能否成功擴(kuò)增出目標(biāo)基因。
  
  2、準(zhǔn)備反應(yīng)體系:將引物、模板DNA、熒光標(biāo)記的探針或染料以及其他必要的反應(yīng)成分混合在一起,形成PCR反應(yīng)體系。其中,熒光標(biāo)記的探針或染料用于后續(xù)的熒光檢測。
  
  3、進(jìn)行PCR反應(yīng):將反應(yīng)體系置于PCR儀中,按照設(shè)定的程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在擴(kuò)增過程中,熒光信號(hào)會(huì)隨著PCR產(chǎn)物的增加而逐漸增強(qiáng)。
  
  4、實(shí)時(shí)檢測和定量:在PCR反應(yīng)進(jìn)行的同時(shí),實(shí)時(shí)監(jiān)測每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)的熒光強(qiáng)度。當(dāng)檢測到的熒光信號(hào)超過設(shè)定的閾值時(shí),記錄此時(shí)的循環(huán)數(shù)(Ct值)。Ct值與起始模板的量成反比,即起始模板量越多,Ct值越小。
  
  5、數(shù)據(jù)分析:根據(jù)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中目標(biāo)基因的起始拷貝數(shù)或相對(duì)表達(dá)量。這一步驟通常由專門的軟件完成。
  
  熒光定量PCR技術(shù)以其高靈敏度、高特異性以及能夠?qū)崿F(xiàn)實(shí)時(shí)定量的特點(diǎn),在生物醫(yī)學(xué)研究、疾病診斷、藥物研發(fā)等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。

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